超分辨率顯微鏡技術(shù)徹底改變了生物學(xué)，因?yàn)樵谶^去十年。 在他們的幫助細(xì)胞組分現(xiàn)在可以在蛋白質(zhì)的大小可視化。 然而，成像活細(xì)胞是對(duì)于大多數(shù)的超分辨率的原則是一個(gè)挑戰(zhàn)。 在這方面，一個(gè)名為uPAINT（通用積分累積成像納米級(jí)地形）技術(shù)抓住了關(guān)注。 此單分子方法利用連續(xù)標(biāo)記，任意生物分子膜的動(dòng)態(tài)成像在活細(xì)胞中以非常高的密度以顯示超分辨的圖像和單個(gè)分子的軌跡。 定位顯微鏡 例如STORM，dSTORM / GSDIM或（SPT）的PALM基于本地化超分辨率技術(shù)基于時(shí)間去相關(guān)的熒光。 通過實(shí)現(xiàn)分離的分子“發(fā)射，隨后將其定位與subdiffraction精度可以用來重建超分辨的圖像。 為了使這些方法來工作，視場內(nèi)的分子的絕大多數(shù)必須處于非發(fā)光狀態(tài)。 為了實(shí)現(xiàn)熒光發(fā)射的時(shí)間分離，制定了幾種方法： STORM（隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡）方法，通過將大多數(shù)人口的進(jìn)入一個(gè)黑暗的狀態(tài)，具有高功率激光照明的幫助下實(shí)現(xiàn)單分子的時(shí)間分辨熒光.為了使這種方法的工作樣品必須被嵌入在氧化或還原緩沖劑以穩(wěn)定的熒光團(tuán)的斷開狀態(tài)。 隨機(jī)的分子的一個(gè)亞群逸出從暗狀態(tài)和發(fā)出熒光。 這種“對(duì)速度”可以是微調(diào)由圍繞標(biāo)本和照明與第二激光（405納米）的解決方案，它減少了在關(guān)閉狀態(tài)的壽命。 PALM（圖片激活定位顯微鏡）技術(shù)采用光活化/敞篷熒光蛋白，可以“變身”開和關(guān)。激活后，他們進(jìn)行成像，直到他們漂白。 在這種情況下，激活光源的強(qiáng)度決定了熒光激活率。 用定位顯微鏡技術(shù)的幫助下，一個(gè)子衍射分辨率達(dá)到和細(xì)胞組分可在前所未有的細(xì)節(jié)進(jìn)行可視化。 然而存在用于這些類型的方法實(shí)現(xiàn)，即天然蛋白質(zhì)的超分辨圖像上活細(xì)胞的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。 當(dāng)研究人員要求，研究內(nèi)源性蛋白在高密度在活細(xì)胞中，無論是STORM 也PALM技術(shù)完美地完成所有必需的前提條件。在基于STORM的情況下，接近降低成像緩沖區(qū)與活細(xì)胞不兼容。 PALM又取決于遺傳修飾的嵌合光活化的熒光蛋白質(zhì)的利用率，從而內(nèi)源性蛋白不能被觀察到。 通用積累點(diǎn)成像的納米地形（uPAINT）是一個(gè)復(fù)雜的技術(shù)規(guī)避這些問題。它的工作原理是動(dòng)態(tài)成像單分子軌道上下偏斜照明細(xì)胞表面，因此導(dǎo)致在超分辨的天然生物分子的行為的跟蹤，在活細(xì)胞的表面上。 相比之下，傳統(tǒng)的定位顯微鏡方法，其利用用于成像的分子的一小部分隨機(jī)的熒光發(fā)射，uPAINT由成像低濃度的熒光配體，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)合，并與它們的靶相互作用的小光量內(nèi)實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的時(shí)間分離。 該uPAINT原則 通用PAINT追溯到原來的做法稱為漆 （點(diǎn)積累的成像納米拓樸圖）。用于此目的的熒光標(biāo)記的探針擴(kuò)散在溶液中，并開始在結(jié)合到感興趣的對(duì)象，以發(fā)出熒光。阿列克謝Sharanov和Robin Hochstrasser通過連續(xù)靶向脂質(zhì)雙層和大單層囊泡與尼羅紅是不發(fā)熒光的水溶液而開始發(fā)熒光在疏水環(huán)境中引入這種方法。在水中快速分子擴(kuò)散導(dǎo)致尼羅紅的恒定通量在膜的附近。隨后出現(xiàn)從它進(jìn)入膜的時(shí)刻的熒光信號(hào)。在這種新的環(huán)境探測成為熒光和流動(dòng)性急劇下降，使得其檢測帶攝像頭（幾毫秒），直到光漂白發(fā)生。 通過確定每個(gè)單獨(dú)的熒光信號(hào)，大約分辨率的心25（nm）是可能的。 然而，由于非常短的持續(xù)時(shí)間插入（毫秒）就不可能追蹤單個(gè)分子在長時(shí)間內(nèi)的行為。（奧林巴斯顯微鏡） 后來格雷戈里Giannone和Eric Hosy重點(diǎn)，克服一些原漆技術(shù)的局限性。 通過使用特定的熒光配體（即抗體）代替非特異性膜染料，單，特定蛋白質(zhì)相互作用的動(dòng)態(tài)成像成為可能。由于更廣泛的應(yīng)用帶寬，這種方法被命名為通用PAINT。 對(duì)于這種技術(shù)背景未結(jié)合標(biāo)記的配體存在于培養(yǎng)基中的熒光，通過使用斜光 （圖1）克服。從轉(zhuǎn)移其預(yù)期使用TIRF激光是關(guān)鍵。發(fā)送激光略低于臨界角向載玻片導(dǎo)致了“ 高度傾斜和層壓光學(xué)片 ”（HILO）傾斜穿過試樣的形成。 本卷中只有熒光很興奮。 低濃度的標(biāo)記的配體加入到介質(zhì)洗澡的檢體內(nèi)部的緩沖器。布朗擴(kuò)散導(dǎo)致配體在細(xì)胞表面的連續(xù)和隨機(jī)結(jié)合到它們的目標(biāo)。希洛光路內(nèi)只熒光很興奮和成像（圖1）。